近期由华中科技大学同济医学院附属协和医院泌尿外科潘峰、章小平教授，同济医学院生殖医学中心熊承良教授，同济医学院生殖健康研究所李红钢教授，哥伦比亚大学医学院泌尿外科 Joseph Alukal教授，康奈尔大学医学院男性生殖与显微外科中心李石华(Philip S. Li)教授和犹他大学医学院泌尿外科Jingtao Guo和Jemes Hotaling教授研究团队，共同在美国生殖医学权威期刊Fertility and Sterility发表题为No evidence of SARS-CoV-2 in semen of males recovering from COVID-19 的专题特邀论文。研究发现在34例确诊新冠肺炎(COVID-19)成年男性患者的前瞻性队列临床研究中，在精液中没有检测到新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。单细胞测序结果显示新冠病毒入侵细胞受体ACE2和TMPRSS2在人睾丸细胞中共定位表达稀疏。研究结果初步确定SARS-CoV-2不太可能通过精液或性接触进行传播。该论文的结论对当今全球疫情期间所涉及的生殖健康和全球公共卫生等问题有十分重要的意义。
此前，人们对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)对男性生殖功能的影响了解非常有限。在这项前瞻性研究中，作者们对新冠肺炎(COVID-19)患者精液中进行检测SARS-CoV-2，同时结合团队前期在美国完成的相关研究报道的单细胞转录水平观察ACE2和TMPRSS2在睾丸内的表达谱数据。此项研究的目标是：1. 在确诊新冠肺炎(COVID-19)患者精液中是否存在新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染？2. 确定人睾丸中ACE2和TMPRSS2的表达谱，提供病毒侵入并对男性生殖系统功能影响的机制。
2019年12月下旬COVID-19在武汉首先报道，目前已在全球范围内报告超过百万例。尽管病毒的传播主要通过呼吸道飞沫，但SARS-CoV-2已从血液和粪便中分离出来，引发了有关包括精液在内的其他体液中存在病毒以及其他传播方式的问题。与非典肺炎病毒(SARS-CoV)相似，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)可能通过病毒S蛋白与ACE2之间的相互作用介导病毒进入靶细胞。ACE2在多种器官系统中表达，包括肺脏II型肺泡细胞、肠道、心脏、肾脏和睾丸。由TMPRSS2首先启动S蛋白，以增强ACE2介导的病毒侵入。
病毒感染后常累及男性生殖道和睾丸(例如腮腺炎性睾丸炎)。睾丸免疫豁免机制通常可使具有免疫原性的生殖细胞免受自身免疫系统攻击，从而为病毒播散提供独特环境。关于SARS-CoV-2感染后病毒播散和进入男性生殖道细胞的证据尚不明确。
方法：2020年1月26日至3月2日在武汉确诊COVID-19的成年男性患者(18岁-57岁)，在通过伦理委员会审查和签署知情同意后，患者提供射精精液样本，共招募34名成年男性患者参加本研究。收集精液样本距COVID-19确诊的中位时间为31天(8天-75天)。
根据初始临床症状(发热、咳嗽，咽痛和呼吸窘迫)、胸部CT和咽拭子样本进行定量逆转录酶-聚合酶链反应(qRT-PCR)确诊为新冠肺炎，使用自动核酸提取系统提取SARS-CoV-2病毒核酸。RT-PCR扩增并测试两个靶基因，包括开放阅读框1ab(ORF1ab)和核衣壳蛋白(N)。根据中国病毒疾病防控所建议，将＜37的循环阈值定义为阳性测试结果，将≥40的循环阈值定义为阴性测试结果。相同的方案用于精液样品中SARS-CoV-2的检测。
为研究ACE2和TMPRSS2在睾丸不同细胞中的基因表达水平，进行人睾丸单细胞转录组测序(scRNA-seq)，并进行数据集分析，标记主要的睾丸细胞类型。报告ACE2和TMPRSS2的单细胞水平表达和共定位。
结果：34例男性患者，平均年龄为37岁(18岁-55岁)，BMI为25.0(18.1-35.5)，其中17例(50％)超重(BMI>25)。在SARS-CoV-2检测阳性后的一个月中，未在精液中检测出SARS-CoV-2。6例患者(19％)主诉阴囊不适症状。
图中显示人睾丸细胞在单细胞转录水平上ACE2和TMPRSS2的表达情况。采用降维方法(tSNE)显示人睾丸(6490个单细胞)的单细胞转录数据，每个点代表一个单细胞(图A)，并根据不同的细胞类型而呈现不同的着色。通过将ACE2和TMPRSS2的表达投影到tSNE图上，观察到两个基因的表达量都非常低(图B)。随后又检测了每个睾丸细胞中ACE2和TMPRSS2的共表达情况(图C)；6490个细胞中只有4个细胞显示两种基因的共表达(Pearson correlation value=-0.01)，表明重叠表达非常有限。
武汉同济生殖医学专科医院微信公众号 图
讨论：在此项研究中，在近期诊断为COVID-19的成年男性精液中没有检测到SARS-CoV-2。此外，ACE2和TMPRSS2在人睾丸中表达稀疏，几乎没有重叠的基因表达。19％的患者主诉阴囊疼痛，但目前尚不清楚其原因。
人体睾丸内免疫豁免的特殊细胞结构和功能，可使原具有免疫原性的生殖细胞，通过“血睾屏障”免受自身免疫系统攻击，任何全身性炎症反应都有可能会改变这种环境。很多病毒感染人体后可以在精液中检测到病毒，并可导致睾丸炎，例如腮腺炎和寨卡病毒。这些病毒可能对男性生殖功能产生不利影响。
在此项研究报道之前，SARS-CoV-2对男性生殖功能的影响尚不清楚。2006年Xu等报道了6例因非典肺炎病毒(SARS-CoV)并发症死亡的男性尸体解剖后的睾丸病理，发现在复杂的炎症浸润情况下，生精细胞和精子被广泛破坏。尽管他们无法从SARS-CoV分析出基因组特征，但他们推测SARS-CoV可导致睾丸炎和生殖功能损害。ACE2可能是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)进入细胞的受体，先前已定位于人睾丸Leydig和Sertoli细胞。但此项研究中的单细胞测序数据表明ACE2 RNA表达水平较低。因此，在人睾丸内不太可能发生ACE2介导的SARS-CoV-2进入宿主靶细胞。这表明有必要对SARS-CoV-2改变睾丸微环境的其他生物学机制进行研究。
此项研究也有一定的局限性，例如结果受到样本量小和选择偏倚的影响，因为此项研究中COVID-19男性患者更有可能表现出较轻的症状。先前的研究表明，较高的病毒载量与更严重的疾病症状相关，未达到穿过血睾屏障的病毒血症或一定的病毒阈值是一种合理的推测。此外，考虑到有关从精液标本中传播病毒的生物安全性问题，并未进行全面的精液分析检测。此外，该研究仅在RNA表达水平上检测ACE2和TMPRSS2的表达。由于基因表达并不完全能够反映蛋白质的丰度，因此并无法明确得出这些蛋白质缺失的结论。后续的研究可以集中在ACE2和TMPRSS2在调节睾丸中SARS-CoV-2感染的分布及其作用。
结论：先前被诊断出COVID-19的成年男性，在最初被感染后约一个月，精液中没有检测到SARS-CoV-2。因此，SARS-CoV-2不太可能通过精液或性接触进行传播。此外，在先前发表的高度保真的RNA数据集中，ACE2和TMPRSS2共表达水平很低，表明SARS-CoV-2可能无法通过ACE2/TMPRSS2介导机制进入睾丸细胞。需要进一步研究了解SARS-CoV-2对男性生殖功能的远期影响。
国际著名生殖医学专家、斯坦福大学医学中心男性生殖外科主任Michael L. Eisenberg教授，同期发表了题为“新型冠状病毒(COVID-19)与男性生殖健康”的评论，对这篇文章的重要价值给予充分肯定。
随着COVID-19在全球范围流行蔓延，科学界持续进行SARS-CoV-2病毒病理生理学研究，揭示其传播性、易感性并为治疗提供指导。呼吸系统感染导致的症状包括发热、咳嗽、呼吸急促等。在感染者的鼻腔分泌物、痰液、粪便中可检测到具有高度传染性的病毒，在血液中很少(1％)，在尿液中则未检测到。虽然已经报道COVID-19患者的心脏、眼睛和神经系统症状，但新冠状病毒对生殖功能的影响仍然未知。有报道显示男性患者有较高的感染率、发病率和死亡率，将学者们的注意力转移到了潜在的男性基因易感性。科学家已确定冠状病毒进入细胞的主要途径，即通过S蛋白附着在宿主ACE2受体上，并由TMPRSS2来启动S蛋白，已知这两者都存在于睾丸中，由此引起对新冠状病毒可能导致睾丸感染和性传播的关注。
在此项研究中，Pan及其同事针对COVID-19可能涉及睾丸的相关问题进行探讨，在34名男性精液中并未发现SARS-CoV-2，病毒不会（或几乎不可能）通过精液传播，该项研究结果令人宽慰。需要注意的是，研究中男性通常为急性感染后几周进行检测，一些患者只有轻微症状，可以想象在更早的时间点或更高的病毒负荷量可能会导致不同的结果。但是考虑到精子生成和输送过程的正常周期，这种可能性似乎较小。
考虑到SARS-CoV-2进入细胞的已知机制，以及对ACE和TMPRSS2蛋白双重表达的要求，作者使用单细胞转录组测序数据分析显示，在6490个睾丸细胞中只有4个细胞(<0.1％)含两种蛋白质RNA。因此，SARS-CoV-2似乎不可能如假设中那样进入睾丸中的任何细胞(如生精细胞、Leydig细胞和Sertoli细胞等)。
作者同时报告了另一种临床表现，即在COVID-19感染患者中，17.6％(6/34)的男性伴随阴囊不适。COVID-19主要集中于严重的全身或呼吸系统症状，提示在未来的筛查中应注意这些临床表现，并进一步了解其病理生理以及对生殖的影响。本报告中由于客观原因无法评估参与者精液质量参数的变化，因此仍然未知病毒是否会影响受感染男性的生育力。先前其他发热疾病的数据表明，急性疾病和体温升高(如发热)可暂时影响精子发生，COVID-19是否遵循此种模式，仍有待阐明。此外，由于新冠状病毒感染者中80％以上为无症状感染者，对这些人群的生殖功能是否有影响尚不清楚。
本次研究报告是SARS-CoV-2与人类生育力之间关系的首次探索。辅助/非辅助生殖女性在COVID-19急性感染期或康复期受到如何影响及其预后仍有待研究。鉴于受当前全球疫情的影响，病毒可能会持续流行一段时间，全球每年将有超过1亿婴儿出生，应进一步研究SARS-CoV-2对生殖功能的影响。
